O jogo coloca-nos numa viagem no tempo, em duas linhas temporais distintas. No presente somos Desmond Miles, um barman que acorda preso numa espécie de laboratório, onde nos são feitos testes. Na verdade, esta empresa utiliza uma máquina capaz de aceder às nossas memórias, que segundo a teoria, passam de geração em geração através do ADN. Sem sabermos o que nos aguarda, e num mistério que prevalece até ao final, iremos reviver o passado do seu ancestral, um assassino do tempo da terceira Cruzada, mais propriamente o ano de 1191.

Desta forma, passamos a ser Altair, um membro da ordem dos Hashshashin, assassinos inimigos dos paladinos templários, que fomentam a Cruzada. O seu objectivo é encontrar e assassinar nove líderes templários, descobrindo uma conspiração. No início da história vemos como Altair é despojado das suas armas e capacidades, por um erro cometido, sendo-lhe dada uma segunda oportunidade. É desta forma que iremos controlar o melhor dos assassinos, enquanto ganha as suas capacidades ao longo da narrativa.
 
O ambiente para o qual somos transportados é fantástico, começando logo pelo início, num castelo numa aldeia, que serve como base de operações da nossa ordem. É aqui que vamos recebendo instruções do nosso líder Masyaf, sobre os próximos alvos a assassinar.